电影的故事发生在《美国队长3：内战》和《复仇者联盟3：无限战争》之间，黑寡妇娜塔莎·罗曼诺夫因为违反了索科维亚协议，被美国政府通缉，不得不躲藏在挪威的一个安全屋。在那里，她收到了一份来自她妹妹叶莲娜的包裹，里面有一种能够解除红房对黑寡妇的思维控制的合成药剂。红房是一个训练女性特工的秘密组织，娜塔莎和叶莲娜都曾经是其中的一员，但娜塔莎后来逃离了红房，加入了神盾局和复仇者联盟。叶莲娜则一直被红房的首领德雷科夫操控，直到她在一次任务中接触到了合成药剂，恢复了自由意志。她希望娜塔莎能够回来，帮助她解救其他被红房控制的黑寡妇。娜塔莎前往布达佩斯与叶莲娜会面，两人一起逃避了红房派来的杀手模仿大师的追杀。模仿大师是一个能够复制任何人的技能和外貌的神秘人物，他也是德雷科夫的得力助手。娜塔莎和叶莲娜决定找到他们的养父阿历克谢，他曾经是苏联的超级士兵，被称为红色守卫者。他们帮助他从一所俄罗斯的监狱中越狱，希望他能告诉他们红房的位置。但阿历克谢并不知道，他让她们去找他们的养母梅丽娜，她是一个科学家，曾经研发了红房的思维控制技术。娜塔莎和叶莲娜与梅丽娜在圣彼得堡重聚，但梅丽娜已经出卖了她们，把她们的位置告诉了德雷科夫。德雷科夫的部下抓住了她们，把她们带到了红房的空中基地。在那里，娜塔莎发现了一个惊人的真相：模仿大师其实是德雷科夫的女儿安东妮雅，她曾经被娜塔莎在一次刺杀德雷科夫的行动中炸伤，德雷科夫为了救她，给她植入了一个能够控制她的芯片，把她变成了一个无情的杀手。娜塔莎也发现，她无法攻击德雷科夫，因为他利用了一种费洛蒙锁，让所有的黑寡妇在闻到他的气味时，就失去了对他的敌意。德雷科夫还向娜塔莎炫耀了他的控制台，他可以通过它操纵全世界的黑寡妇，执行他的阴谋。娜塔莎为了打破费洛蒙锁的效果，故意撞断了自己的鼻腔神经，然后攻击了德雷科夫。叶莲娜和阿历克谢也从牢房中逃了出来，与梅丽娜汇合。梅丽娜表示她只是假装出卖她们，其实她已经破坏了飞船的引擎，让它开始坠落。叶莲娜找到了其他被德雷科夫派来保护他的黑寡妇，用合成药剂解除了她们的思维控制。娜塔莎把全世界的黑寡妇的位置和资料复制到了一个硬盘中，然后逃离了控制台。德雷科夫想要逃生，但叶莲娜用一枚炸弹炸毁了他的逃生舱，让他死在了飞船里。娜塔莎给了叶莲娜一副降落伞，让她离开，自己则留下来和安东妮雅进行最后的决斗。最后，两人都安全地降落在地面上。娜塔莎用最后一瓶合成药剂让安东妮雅恢复了自我，安东妮雅向娜塔莎道歉，娜塔莎也原谅了她。其他的黑寡妇陆续降落在地面上，叶莲娜、阿历克谢和梅丽娜与娜塔莎道别，叶莲娜把自己的背心送给了娜塔莎，希望她能记住她们的家庭。一行人带着恢复正常的安东妮雅离开，娜塔莎则等待着美国政府的到来。两个星期后，娜塔莎染了一头金发，与她的朋友梅森汇合，梅森给她一架昆式战斗机，让她去救出其他被囚禁的复仇者。在片尾彩蛋中，叶莲娜来到了娜塔莎的墓地，遇到了一个叫瓦伦蒂娜的女人，她给叶莲娜一个任务：杀死导致娜塔莎死亡的人，也就是鹰眼。